Assay zur Zellmigration

Oris-Tests bieten eine physiologisch relevantere Umgebung als Boyden-/Transwell-Tests, da es keine künstliche Membran gibt, durch die die Zellen hindurchgehen müssen. Darüber hinaus können die Zellbewegungen in Oris-Tests in Echtzeit überwacht werden, da keine Membran die mikroskopische Beobachtung stört. Dies liefert nicht nur mehr Informationen, sondern beschleunigt auch die Entwicklung von Methoden, da der Endpunkt durch einfache Beobachtung des Assays erkennbar ist.

Der Oris 3D Embedded Invasion Assay ist den Boyden/Transwell-Assays für die Zellinvasion auch deshalb überlegen, weil die Zellen während des gesamten Assays in 3D eingebettet sind, während die Zellen in Boyden/Transwells-Assays auf einer 2D-Oberfläche ausgesät werden, was die Zellphysiologie erheblich verändert (z. B. Referenzen 1,2,3,4,5,6,7,8).

Oris-Zellwanderungstests beschädigen die Zellen nicht, während Scratch-Tests dies tun. Noch wichtiger ist, dass die einheitliche zellfreie Erkennungszone für viel robustere Statistiken sorgt als bei Scratch-Assays, da diese Veröffentlichung und dieser Anwendungshinweis veranschaulichen.

Nein. Wir empfehlen die Oris Universal Cell Migration Assembly Kits, wenn Sie die Platten selbst beschichten möchten. Bei diesen Kits sind die Platten und Stopfen separat verpackt. Beschichten Sie die Platten wie gewünscht und setzen Sie die Stopfen erst kurz vor Beginn Ihres Experiments ein.

Oris Migration, Oris Invasion, Oris Pro Migration und Oris 3D Embedded Invasion Assays sind so konzipiert, dass sie mit den meisten adhärenten Zelllinien funktionieren. Nicht-adhärente Zellen können auch im Oris 3D Embedded Invasion Assay verwendet werden. Platypus hat viele erfolgreiche Tests von Oris Produkten mit HT-1080, MDA-MB-231, PC3 und HUVEC Zellen durchgeführt. Viele andere Zelllinien wurden von Kunden wie Ihnen mit Oris verwendet, da ein Google Scholar Suche nach ("Oris" UND "Zellmigration") ergeben.

Streben Sie zu Beginn des Experiments 95-100% konfluente Monolayer um die Zellausschlusszone an. Die Aussaat einer höheren Dichte kann dazu führen, dass sich zu Beginn des Versuchs Zellen in der Erkennungszone befinden, während die Aussaat einer geringeren Dichte dazu führt, dass nach der Migration weniger Zellen in die Erkennungszone wandern. In der Regel werden 20.000 - 75.000 Zellen pro Vertiefung in Oris und Oris Pro 96-Well-Platten und 2.500 - 10.000 pro Vertiefung in Oris Pro 384-Well-Platten ausgesät. Für Ihr erstes Experiment empfehlen wir Ihnen, mehrere verschiedene Zellaussaatdichten zu testen, wie in Anhang 1 in der Testprotokoll.

Für Oris 3D Embedded Invasion Assays empfehlen wir eine Aussaat von 30.000 - 50.000 Zellen pro Vertiefung. Bei einigen Zelllinien können bis zu 75.000 Zellen pro Vertiefung ausgesät werden, aber viele invasive Zelllinien exprimieren hohe Mengen an Matrix-Metalloproteinasen, die das Kollagen so weit abbauen können, dass es kollabiert oder sich bei hohen Zelldichten sogar verflüssigt. Durch die Zugabe von weniger Zellen wird dieses Problem gemildert.

Um die besten Statistiken zu erhalten, wählen Sie eine Testzeit, die dazu führt, dass die unbehandelten Zellen mindestens 2/3 der ursprünglichen offenen Fläche der Detektionszone schließen, aber weniger als 100% Schließung. Ein Vorteil der Oris Zellwanderungs- und Invasionstests ist, dass Sie das Experiment jederzeit während der Inkubationszeit überprüfen können, um festzustellen, wie weit sich die Zellen bewegt haben. Wenn Sie zum ersten Mal einen Oris-Assay durchführen, beobachten Sie die Zellen einfach regelmäßig unter dem Mikroskop, um das Ausmaß der Migration/Invasion zu beurteilen, und beenden Sie das Experiment, wenn das entsprechende Ausmaß der Bewegung beobachtet wird.

Da die Geschwindigkeit der Zellbewegung von Zelltyp zu Zelltyp sehr unterschiedlich ist, variieren die optimalen Inkubationszeiten bei den verschiedenen Zelltypen. Die Migrationszeiten können zwischen 16 und 72 Stunden variieren, während die Invasionszeiten zwischen 1 und 6 Tagen liegen können. Bei längeren Experimenten empfehlen wir, das oben genannte Kulturmedium alle 48-72 Stunden mit frischen Inhibitoren zu wechseln.

Die Oris-Kits sind für die Verwendung in einem einzigen Experiment konfiguriert. Bei Oris müssen die Stopfen bis zur Verwendung gekühlt gelagert werden, um die perfekte strukturelle Passung zu erhalten, die die reproduzierbare, eng begrenzte Ausschlusszone erzeugt. Bei OrisPro hydratisiert die Luftfeuchtigkeit im Inkubator das Gel in den unbenutzten Vertiefungen, was zu Schwankungen in der Größe der Ausschlusszone und der Auflösungszeit des Gels in nachfolgenden Experimenten führt.

Wenn Sie weniger als 96 Wells pro Experiment benötigen, sollten Sie das Oris Cell Migration Assembly Kit - FLEX in Betracht ziehen, das vier 96-Well-Platten und vier Packungen mit 24 Stopfen enthält. Verwenden Sie jede Platte nur einmal, mit einer beliebigen Anzahl von Stopfen, die ein Vielfaches von vier ist.

Nein. Die Stopfen müssen bis zur Verwendung gekühlt gelagert werden, um die perfekte strukturelle Passform zu erhalten, die die reproduzierbare, eng begrenzte Ausschlusszone erzeugt. Stöpsel, die über einen längeren Zeitraum bei 37 °C gelagert wurden, passen nicht richtig, was zu unregelmäßigen, variablen Ausschlusszonen führt.

Die Spitze eines ordnungsgemäß eingesetzten Stopfens erzeugt ein Bullaugenmuster am Boden der Vertiefung. Um dieses Bull's-Eye-Muster zu sehen, drehen Sie die Platte nach dem Einsetzen der Stopfen um und kippen Sie die Platte in einem Winkel. Sie können dieses Bullenaugenmuster in der Mitte jeder Vertiefung durch die klare Bodenfläche sehen. Stöpsel, die nicht gut verschlossen haben, können erneut eingesetzt werden, bis die Spitze richtig platziert ist.

Nein. Obwohl 96-Well-Platten "Industriestandard" sind, variieren die Abmessungen der Vertiefungen von Anbieter zu Anbieter. Da der Stopfen perfekt passen muss, um eine reproduzierbare, eng begrenzte Ausschlusszone zu erzeugen, funktionieren nur Oris-Platten richtig.

Sichern Sie zunächst die Platte, indem Sie sie fest gegen Ihre Arbeitsfläche drücken. Als Nächstes schieben Sie die Zinken des Stopfers zwischen die Oberseite des Stopfers und das Rückgrat des Stopfers, wobei Sie die Unterseite des Stopfers parallel zur Oberseite der Platte halten. Zum Schluss heben Sie das Stopfenwerkzeug vertikal an, um den Stopfen vorsichtig zu entfernen. Verwenden Sie das Stopfenwerkzeug nicht als Hebel, um die Stopfen aus der Vertiefung zu hebeln, da dies zu einer Verschiebung der Zellen führen kann. War diese Antwort hilfreich? Ja / Nein

Prä-Migrations-/Invasions-Referenzvertiefungen werden verwendet, um die Größe und Position der Erfassungszone zu bestimmen, damit das Ausmaß der Bewegung in den Versuchsvertiefungen quantifiziert werden kann.

Bei Oris Assays können Sie einige Stopfen an Ort und Stelle lassen, bis Sie die Ergebnisse ablesen. Da Oris Pro Assays keine Stopfen haben, ist diese Methode nicht anwendbar.

Für Oris Pro und Oris Assays gibt es alternative Methoden zur Erstellung von Referenzvertiefungen:
Sammeln Sie einfach Bilder zum Zeitpunkt Null, wenn die Migration beginnt.
Geben Sie das Fixiermittel zu Beginn des Tests in die Replikationsvertiefungen oder in die Replikationsplatte. Bei der Fixierung von Zellen in einer Untergruppe von Vertiefungen in der Platte besteht jedoch die Gefahr, dass die Zellen neben den fixierten Vertiefungen durch die Dämpfe des Fixiermittels beeinträchtigt werden.
Geben Sie zu Beginn des Tests einen Migrations- oder Invasionsinhibitor, wie z. B. Cytochalasin D, in die Referenzvertiefungen. Achten Sie darauf, dass Sie genügend Inhibitor hinzufügen, um die Zellbewegung vollständig zu blockieren.

Lesen Sie auch den zugehörigen Anwendungshinweis hier.

Die Testplatte kann nach dem Entfernen der Oris Stopfen oder dem Auflösen des Oris Pro Gels erschüttert worden sein. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie die Platten von der Arbeitsfläche in den Inkubator transportieren.

Die Zelllinie haftet möglicherweise nur schlecht an der Plattenoberfläche. Mögliche Lösungen sind:
Wenn Sie eine mit TC behandelte Platte verwendet haben, versuchen Sie eine mit Kollagen I oder Fibronektin beschichtete Platte, um eine bessere Haftung zu erreichen.
Bei der Verwendung von Oris-Assays muss die Adhäsionszeit der Zellen vor der Zugabe von Kulturmedium verlängert werden.
Wenn Sie Oris Pro Assays verwenden, versuchen Sie, das Volumen, in das die Zellen ausgesät werden, zu verringern, damit sie die Plattenoberfläche schneller erreichen.

Wenn die Zelldichte hoch ist, versuchen Sie, weniger Zellen auszusäen, damit alle Zellen die Möglichkeit haben, zu haften.

Klopfen Sie bei Oris Stopper-basierten Assays leicht auf die Arbeitsfläche, um die Zellen gleichmäßig zu verteilen, nachdem Sie die Zellen ausgesät haben, aber bevor Sie die Stopfen entfernen.

Bei Oris-Tests geben Sie die Prüfsubstanzen in das Kulturmedium, sobald die Zellen angeheftet sind und die Stopfen entfernt wurden, aber bevor die Migration beginnt.

Bei Oris Pro Assays geben Sie die Testsubstanzen zu, sobald sich das BCG aufgelöst hat und die Zellen angeheftet sind, aber bevor die Migration beginnt.
Sowohl bei den Oris- als auch bei den Oris Pro-Tests hängt die Adhäsionszeit von der Zelllinie und der Plattenbeschichtung ab, wobei die Anheftungszeiten variieren. Sie können das Medium vor der Zugabe der Prüfsubstanzen entfernen und ersetzen, um alle nicht haftenden Zellen zu eliminieren. Bei den Invasionstests können die Verbindungen in die Kollagen-I-Lösungen eingearbeitet und/oder dem Kulturmedium über dem Kollagen zugesetzt werden.

Es gibt mehrere Möglichkeiten, die einfachste zuerst:
Führen Sie den Assay kürzer als die Zellverdopplungszeit durch, um die Proliferation zu begrenzen.
2. Fügen Sie einen Proliferationshemmer wie Actinomycin D hinzu, der weder die Migration noch die Invasion hemmt.
Immunfärbung mit einem Anti-Ki67-Antikörper, einem Marker, der nur auf proliferierenden Zellen zu finden ist, und Ausschluss der Ki67-positiven Zellen aus den Ergebnissen.
Überwachen Sie den Test durch Videomikroskopie, um den Verlauf jeder Zelle während des Tests zu verfolgen. Dies ist ein zeitaufwändiger und datenintensiver Ansatz, der teure Geräte erfordert.

Zellen sind in der Regel unter Hellfeldoptik ohne Färbung sichtbar, insbesondere wenn Phasenkontrastoptik vorhanden ist. Mit einer Färbung sind die Zellen jedoch leichter zu erkennen und können physiologische Zustände zeigen, die mit der Hellfeldoptik nicht erkennbar sind. Bei den Oris Assays gibt es keine Einschränkungen bei der Wahl der Färbung, und Sie können auf Wunsch mehrere Färbungen gleichzeitig verwenden.
Zur Quantifizierung der Migration/Invasion über den Flächenschluss empfehlen wir eine fluoreszierende zytoplasmatische Färbung wie TRITC-Phalloidin, um die Signale für Ihren Detektor zu maximieren.

Um die Migration/Invasion durch Zählen der Zellen zu quantifizieren, empfehlen wir eine Kernfärbung wie DAPI. Durch die Beschränkung der Färbung auf die Zellkerne entstehen kleinere Objekte für die Bildgebung als bei zytoplasmatischen Färbungen, was eine bessere Trennung zwischen einzelnen Zellen und somit eine genauere Zählung ermöglicht.

Sie können auch in Erwägung ziehen, die Zellen vor der Aussaat in den Oris-Assays vorzufärben. Einige Färbemittel können jedoch die Migration und/oder Invasion beeinflussen, was zu experimentellen Artefakten führen kann.