세포 이동 분석

Oris 분석은 세포가 통과해야 하는 인공적인 막이 없기 때문에 Boyden/트랜스웰 분석보다 생리적으로 더 적합한 환경을 제공합니다. 또한 Oris 분석에서는 현미경 관찰을 방해하는 막이 없기 때문에 세포의 움직임을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이는 더 많은 정보를 제공할 뿐만 아니라 단순히 분석을 관찰하는 것만으로도 최종 지점을 명확히 알 수 있기 때문에 분석법 개발을 가속화할 수 있습니다.

Oris 3D 임베디드 침입 분석은 세포 침입에 있어 Boyden/트랜스웰 분석보다 더욱 우수한데, 이는 세포가 분석 전체에 걸쳐 3D로 임베디드되는 반면, Boyden/트랜스웰 분석에서는 세포가 2D 표면에 시드되어 세포 생리학이 크게 변화하기 때문입니다(예 1,2,3,4,5,6,7,8).

스크래치 분석은 세포를 손상시키는 반면, Oris 세포 이동 분석은 세포를 손상시키지 않습니다. 더 중요한 것은 균일한 무세포 검출 영역이 스크래치 분석보다 훨씬 더 강력한 통계를 제공한다는 점입니다. 이 간행물 그리고 이 애플리케이션 노트 를 예로 들어 설명합니다.

아니요. 플레이트를 직접 코팅하려면 Oris 범용 셀 마이그레이션 조립 키트를 권장합니다. 이 키트는 플레이트와 스토퍼가 별도로 포장되어 제공됩니다. 원하는 대로 플레이트를 코팅한 다음 실험을 시작하기 직전에 스토퍼를 삽입합니다.

Oris Migration, Oris Invasion, Oris Pro Migration 및 Oris 3D 임베디드 침입 분석은 대부분의 부착성 세포주와 함께 작동하도록 설계되었습니다. 비부착성 세포도 Oris 3D 임베디드 침입 분석에 사용할 수 있습니다. Platypus는 HT-1080, MDA-MB-231, PC3 및 HUVEC 세포를 사용하여 Oris 제품을 성공적으로 테스트했습니다. 그 외에도 많은 다른 세포주들이 고객 여러분과 같은 고객들에 의해 Oris의 Google 장학생 ("Oris" 및 "셀 마이그레이션")을 검색하면 표시됩니다.

실험을 시작할 때 세포 배제 영역 주변의 95-100% 합류 단층을 목표로 합니다. 더 높은 밀도로 시딩하면 분석 시작 시 검출 영역에 세포가 많이 발생할 수 있으며, 더 낮은 밀도로 시딩하면 이동 후 검출 영역에서 이동하는 세포가 더 적게 생성됩니다. 일반적으로 Oris 및 Oris Pro 96웰 플레이트에서는 웰당 20,000~75,000개의 세포가 시딩되며, Oris Pro 384웰 플레이트에서는 웰당 2,500~10,000개의 세포가 시딩됩니다. 첫 번째 실험의 경우 부록 1에 설명된 대로 여러 가지 다른 세포 시딩 밀도를 테스트하는 것이 좋습니다. 분석 프로토콜.

Oris 3D 임베디드 침습 분석의 경우 웰당 30,000~50,000개의 세포를 시딩할 것을 권장합니다. 일부 세포주의 경우 웰당 75,000개까지 시딩할 수 있지만, 많은 침습성 세포주는 높은 세포 밀도에서 콜라겐이 붕괴되거나 액화될 정도로 콜라겐을 분해할 수 있는 높은 수준의 매트릭스 메탈로프로테아제를 발현합니다. 세포 수를 줄이면 이 문제가 개선됩니다.

최상의 통계를 얻으려면 처리되지 않은 세포가 검출 영역의 원래 개방 영역의 2/3 이상 닫히지만 100% 미만 닫히는 분석 시간을 선택하십시오. Oris 세포 이동 및 침입 분석의 장점은 배양 기간 동안 언제든지 실험을 검사하여 세포가 얼마나 멀리 이동했는지 확인할 수 있다는 것입니다. Oris 분석을 처음 실행할 때는 현미경으로 세포를 주기적으로 관찰하여 이동/침입 정도를 평가하고 적절한 수준의 이동이 관찰되면 실험을 중단하기만 하면 됩니다.

세포 이동 속도는 세포 유형에 따라 크게 다르므로 최적의 배양 시간은 세포 유형에 따라 달라집니다. 이동 시간은 16~72시간, 침입 시간은 1~6일 사이로 다양할 수 있습니다. 실험을 연장하려면 48-72시간마다 새로운 억제제로 위의 배양 배지를 교체하는 것이 좋습니다.

Oris 키트는 한 번의 실험에 사용하도록 구성되어 있습니다. Oris의 경우, 재현 가능하고 단단하게 경계가 지정된 배제 구역을 생성하는 완벽한 구조적 적합성을 유지하기 위해 사용할 때까지 스토퍼를 냉장 보관해야 합니다. OrisPro의 경우 인큐베이터의 습도가 미사용 웰의 겔을 수화시켜 후속 실험에서 배타 영역 크기와 겔 용해 시간에 가변성을 유발할 수 있습니다.

실험당 96웰보다 적은 수의 웰이 필요한 경우 96웰 플레이트 4개와 24개의 스토퍼 팩 4개가 포함된 Oris 세포 이동 조립 키트 - FLEX를 고려하십시오. 각 플레이트는 4의 배수인 스토퍼 수에 상관없이 한 번만 사용하십시오.

아니요. 재현 가능하고 단단하게 경계가 잡힌 제외 구역을 생성하는 완벽한 구조적 맞춤을 유지하기 위해 마개는 사용할 때까지 냉장 보관해야 합니다. 37°C에서 오래 보관한 마개는 제대로 밀착되지 않아 불규칙하고 가변적인 제외 구역을 만들 수 있습니다.

제대로 삽입된 마개의 끝은 우물 바닥에 과녁 무늬를 만듭니다. 이 과녁 무늬를 보려면 스토퍼를 삽입한 후 접시를 뒤집어 비스듬히 기울여 보세요. 투명한 바닥면을 통해 각 웰의 중앙에 있는 과녁 무늬를 볼 수 있습니다. 잘 밀봉되지 않은 스토퍼는 팁이 제대로 들어갈 때까지 다시 삽입할 수 있습니다.

96웰 플레이트는 "업계 표준"이지만 웰 치수는 공급업체마다 다릅니다. 재현 가능하고 단단히 경계가 지정된 제외 영역을 생성하려면 스토퍼가 완벽하게 맞아야 하므로 Oris 플레이트만 제대로 작동합니다.

먼저 플레이트를 작업대에 단단히 고정하여 고정합니다. 그런 다음 스토퍼 도구의 아래쪽이 접시 윗면과 평행이 되도록 스토퍼 도구의 틴을 스토퍼 스트립 백본의 상단 사이로 밀어 넣습니다. 마지막으로 스토퍼 도구를 수직으로 들어 올려 스토퍼를 조심스럽게 제거합니다. 스토퍼 도구를 지렛대로 사용하여 웰에서 스토퍼를 들어 올릴 경우 셀이 변위될 수 있으므로 사용하지 마십시오. 이 답변이 도움이 되었나요? 예 / 아니요

사전 이동/침입 참조 우물은 실험 우물에서 이동 범위를 정량화하기 위해 탐지 영역의 크기와 위치를 설정하는 데 사용됩니다.

Oris 분석의 경우 결과를 읽을 때까지 스토퍼를 그대로 두어도 됩니다. Oris Pro 분석에는 스토퍼가 없으므로 이 방법을 적용할 수 없습니다.

Oris Pro 및 Oris 분석의 경우 참조 웰을 설정하는 대체 방법은 다음과 같습니다:
마이그레이션이 곧 시작될 때 0시에 이미지를 수집하기만 하면 됩니다.
분석을 시작할 때 복제 웰 또는 복제 플레이트에 고정액을 추가합니다. 그러나 플레이트의 웰 하위 집합에서 세포를 고정할 때 이 방법을 사용하면 고정 웰에 인접한 세포가 고정 증기에 노출될 수 있으므로 영향을 받을 위험이 있습니다.
분석을 시작할 때 사이토칼라신 D와 같은 이동 또는 침입 억제제를 기준 웰에 추가합니다. 세포 이동을 완전히 차단할 수 있는 충분한 양의 억제제를 추가해야 합니다.

관련 애플리케이션 노트를 읽어보실 수 있습니다. 여기를 클릭하세요.

Oris 스토퍼를 제거하거나 Oris Pro 겔을 용해한 후 분석 플레이트가 흔들렸을 수 있습니다. 작업대에서 인큐베이터로 플레이트를 옮길 때 주의하십시오.

세포주가 플레이트 표면에 잘 부착되지 않을 수 있습니다. 가능한 해결책은 다음과 같습니다:
TC 처리된 플레이트를 사용했다면, 더 나은 접착력을 위해 콜라겐 I 또는 피브로넥틴 코팅 플레이트를 사용해보세요.
Oris 분석법을 사용하는 경우 배양액을 추가하기 전에 세포가 부착될 때까지 더 오랜 시간을 기다리세요.
Oris Pro 분석을 사용하는 경우, 세포가 플레이트 표면에 더 빨리 도달할 수 있도록 시딩하는 부피를 줄이십시오.

세포 밀도가 높으면 모든 세포가 부착할 수 있도록 더 적은 수의 세포를 시드해 보세요.

Oris 스토퍼 기반 분석의 경우, 세포를 시딩한 후 스토퍼를 제거하기 전에 작업 표면에 플레이트를 가볍게 두드려 세포가 고르게 분포되도록 합니다.

Oris 분석의 경우, 세포가 부착되고 마개가 제거된 후 이동이 시작되기 전에 배양 배지에 테스트 화합물을 추가합니다.

Oris Pro Assays의 경우, BCG가 용해되고 세포가 부착된 후 이동이 시작되기 전에 테스트 화합물을 추가합니다.
Oris 및 Oris Pro 분석 모두에서 부착 시간은 세포주 및 플레이트 코팅에 따라 달라집니다. 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 테스트 화합물을 추가하기 전에 배지를 제거하고 교체할 수 있습니다. 침입 분석에서 화합물은 콜라겐 I 용액에 통합되거나 콜라겐 위의 배양 배지에 첨가될 수 있습니다.

가장 간단한 방법부터 몇 가지 옵션이 있습니다:
세포 증식을 제한하기 위해 세포 배가 시간보다 짧은 시간 동안 분석을 실행합니다.
2. 2. 이동이나 침입을 억제하지 않는 액티노마이신 D와 같은 증식 억제제를 추가합니다.
증식하는 세포에서만 발견되는 마커인 항-Ki67 항체로 면역 염색을 하고 결과에서 Ki67 양성 세포를 할인합니다.
비디오 현미경으로 분석을 모니터링하여 분석 중 각 세포의 이력을 확인할 수 있습니다. 이 방법은 고가의 장비가 필요하고 시간이 오래 걸리며 데이터 양이 많은 방식입니다.

특히 위상차 광학 장치를 사용할 수 있는 경우, 세포는 일반적으로 염색 없이도 밝은 필드 광학 장치에서 볼 수 있습니다. 그러나 염색을 하면 세포를 더 쉽게 볼 수 있고, 명시야 광학으로는 볼 수 없는 생리학적 상태를 밝힐 수 있습니다. Oris Assays는 염색 선택에 제한을 두지 않으며 원하는 경우 여러 염색을 동시에 사용할 수 있습니다.
영역 폐쇄를 통한 이동/침입을 정량화하려면 탐지기의 신호를 최대화하기 위해 TRITC-팔로이딘과 같은 형광 세포질 염색을 권장합니다.

세포 수를 세어 이동/침입을 정량화하려면 DAPI와 같은 핵 염색을 권장합니다. 염색을 핵으로 제한하면 세포질 염색보다 이미징할 수 있는 물체가 더 작아져 개별 세포를 더 잘 분리할 수 있으므로 더 정확하게 카운트할 수 있습니다.

Oris 분석에서 시딩하기 전에 세포를 사전 라벨링하는 것도 고려할 수 있습니다. 그러나 일부 염색은 이동 및/또는 침입에 영향을 미쳐 잠재적으로 실험적 아티팩트를 생성할 수 있습니다.