Ensayo de migración celular

Los ensayos Oris proporcionan un entorno fisiológicamente más relevante que los ensayos Boyden / transwell, ya que no existe una membrana artificial a través de la cual deban pasar las células. Además, los movimientos celulares pueden monitorizarse en tiempo real en los ensayos Oris, ya que no hay membrana que interfiera en la observación microscópica. Esto no sólo proporciona más información, sino que también acelera el desarrollo de métodos porque su punto final es evidente con sólo observar el ensayo.

El Oris 3D Embedded Invasion Assay es superior a los ensayos Boyden / transwell para la invasión celular porque las células están incrustadas en 3D durante todo el ensayo, mientras que las células se siembran en una superficie 2D en los ensayos Boyden / transwells, lo que cambia significativamente la fisiología celular (por ejemplo, referencias 1,2,3,4,5,6,7,8).

Los ensayos de migración celular de Oris no dañan las células, mientras que los ensayos de rascado sí lo hacen. Y lo que es más importante, la zona de detección uniforme libre de células proporciona estadísticas mucho más sólidas que los ensayos de rascado, ya que esta publicación y esta nota de aplicación ilustrar.

No. Recomendamos los kits universales de montaje de migración celular de Oris si desea recubrir las placas usted mismo. Estos kits se suministran con las placas y los tapones envasados por separado. Recubra las placas como desee e inserte los tapones justo antes de comenzar el experimento.

Los ensayos Oris Migration, Oris Invasion, Oris Pro Migration y Oris 3D Embedded Invasion están diseñados para funcionar con la mayoría de las líneas celulares adherentes. Las células no adherentes también pueden utilizarse en el ensayo Oris 3D Embedded Invasion Assay. Platypus ha realizado con éxito muchos ensayos de productos Oris con células HT-1080, MDA-MB-231, PC3 y HUVEC. Muchas otras líneas celulares han sido utilizadas por clientes como usted con Oris, como una Google Académico búsqueda ("Oris" Y "migración celular").

Al inicio del experimento, el objetivo es obtener monocapas confluentes 95-100% alrededor de la zona de exclusión celular. La siembra a una densidad más alta puede dar lugar a células en la zona de detección al principio del ensayo, mientras que la siembra a una densidad más baja producirá menos células migratorias en la zona de detección después de la migración. Normalmente, se siembran entre 20.000 y 75.000 células por pocillo en placas Oris y Oris Pro de 96 pocillos, y entre 2.500 y 10.000 por pocillo en placas Oris Pro de 384 pocillos. Para su primer experimento, le recomendamos que pruebe diferentes densidades de siembra de células, tal como se describe en el Apéndice 1 de la Guía del usuario. protocolo de ensayo.

Para los ensayos Oris 3D Embedded Invasion, recomendamos sembrar entre 30.000 y 50.000 células por pocillo. Se pueden sembrar hasta 75.000 células por pocillo para algunas líneas celulares, pero muchas líneas celulares invasivas expresan altos niveles de metaloproteinasas de matriz que pueden degradar el colágeno hasta el punto de colapsarlo o incluso licuarlo a altas densidades celulares. Añadir menos células mejora este problema.

Para obtener las mejores estadísticas, elija un tiempo de ensayo que dé como resultado que las células no tratadas cierren al menos 2/3 del área abierta original de la zona de detección, pero menos de 100% de cierre. Una ventaja de los ensayos Oris de migración e invasión celular es que se puede inspeccionar el experimento en cualquier momento durante el periodo de incubación para comprobar hasta dónde se han movido las células. La primera vez que realice un ensayo Oris, simplemente observe las células periódicamente al microscopio para evaluar el grado de migración/invasión y detenga el experimento cuando observe el grado de movimiento adecuado.

Dado que las tasas de movimiento celular difieren ampliamente entre los distintos tipos celulares, los tiempos de incubación óptimos variarán en función de los distintos tipos celulares. Los tiempos de migración pueden variar de 16 a 72 horas, mientras que los tiempos de invasión pueden variar de 1 a 6 días. Para experimentos prolongados, recomendamos cambiar el medio de cultivo anterior con inhibidores nuevos cada 48-72 horas.

Los kits Oris están configurados para su uso en un único experimento. Para Oris, los tapones deben almacenarse refrigerados hasta su uso para preservar el ajuste estructural perfecto que genera la zona de exclusión reproducible y estrechamente delimitada. Para OrisPro, la humedad de la incubadora hidrata el gel en los pocillos no utilizados, lo que creará variabilidad en el tamaño de la zona de exclusión y en el tiempo de disolución del gel en experimentos posteriores.

Si necesita menos de 96 pocillos por experimento, considere el Oris Cell Migration Assembly Kit - FLEX, que incluye cuatro placas de 96 pocillos y cuatro paquetes de 24 tapones. Utilice cada placa una sola vez, con cualquier número de tapones que sea múltiplo de cuatro.

No. Los tapones deben conservarse refrigerados hasta su uso para preservar el ajuste estructural perfecto que genera la zona de exclusión reproducible y bien delimitada. Los tapones que se hayan conservado a 37°C durante cualquier periodo de tiempo no encajarán correctamente, dando lugar a zonas de exclusión irregulares y variables.

La punta de un tapón correctamente insertado creará un patrón de ojo de buey en el fondo del pocillo. Para ver este patrón de ojo de buey, dé la vuelta a la placa después de insertar los tapones e inclínela en ángulo. Podrá ver este patrón de ojo de buey en el centro de cada pocillo a través de la superficie transparente del fondo. Los tapones que no hayan sellado bien pueden volver a introducirse hasta que la punta quede bien colocada.

No. Aunque las placas de 96 pocillos son "estándar de la industria", las dimensiones de los pocillos varían de un proveedor a otro. Dado que el tapón debe encajar perfectamente para generar la zona de exclusión reproducible y bien delimitada, sólo las placas Oris funcionarán correctamente.

En primer lugar, sujete firmemente la placa contra la superficie de trabajo. A continuación, deslice las púas de la herramienta de tope entre la parte superior de la espina dorsal de la tira de tope, manteniendo la parte inferior de la herramienta de tope paralela a la superficie superior de la placa. Por último, levante la herramienta verticalmente para retirar el tapón con cuidado. No utilice la herramienta como palanca para sacar los tapones del pocillo, ya que podría provocar el desplazamiento de las células.

Los pocillos de referencia previos a la migración/invasión se utilizan para establecer el tamaño y la posición de la zona de detección con el fin de cuantificar el alcance del movimiento en los pocillos experimentales.

Para los ensayos Oris, puede dejar algunos tapones en su lugar hasta que lea los resultados. Dado que los ensayos Oris Pro carecen de tapones, este método no es aplicable.

Para los ensayos Oris Pro y Oris, existen métodos alternativos para establecer pocillos de referencia:
Basta con recoger las imágenes en el momento cero, cuando la migración está a punto de comenzar.
Añadir fijador a los pocillos de réplica o a una placa de réplica al principio del ensayo. Sin embargo, cuando se fijan células en un subconjunto de pocillos de la placa, este método puede afectar a las células adyacentes a los pocillos fijados, ya que pueden quedar expuestas a los vapores del fijador.
Añada un inhibidor de la migración o la invasión, como la citocalasina D, a los pocillos de referencia al principio del ensayo. Asegúrese de añadir suficiente inhibidor para bloquear completamente el movimiento celular.

Si lo desea, puede leer una nota de aplicación relacionada aquí.

La placa de ensayo puede haberse sacudido tras la retirada de los tapones Oris o la disolución del gel Oris Pro. Tenga cuidado al transferir las placas de la superficie de trabajo a la incubadora.

La línea celular puede estar mal adherida a la superficie de la placa. Las posibles soluciones son:
Si ha utilizado una placa tratada con TC, pruebe con una placa recubierta de colágeno I o fibronectina para mejorar la adherencia.
Si se utilizan ensayos Oris, deje transcurrir más tiempo para que las células se adhieran antes de añadir el medio de cultivo.
Si utiliza ensayos Oris Pro, intente reducir el volumen en el que se siembran las células para que alcancen la superficie de la placa más rápidamente.

Si la densidad celular es alta, intente sembrar menos células para que todas tengan la oportunidad de adherirse.

Para los ensayos basados en tapones Oris, golpee ligeramente la placa sobre la superficie de trabajo para distribuir las células uniformemente después de sembrar las células pero antes de retirar los tapones.

Para los ensayos Oris, añada los compuestos de ensayo al medio de cultivo una vez que las células se hayan adherido y se hayan retirado los tapones, pero antes de que comience la migración.

Para los ensayos Oris Pro, añada los compuestos de ensayo una vez que el BCG se haya disuelto y las células se hayan adherido, pero antes de que comience la migración.
Tanto para los ensayos Oris como Oris Pro, el tiempo de adhesión depende de la línea celular y del recubrimiento de la placa, con tiempos de adhesión. Puede retirar y sustituir el medio antes de añadir los compuestos de ensayo para eliminar cualquier célula no adherente. En los ensayos de invasión, los compuestos pueden incorporarse a las soluciones de colágeno I y/o añadirse al medio de cultivo por encima del colágeno.

Hay varias opciones, la más sencilla primero:
1. Realice el ensayo durante menos tiempo que el tiempo de duplicación celular para limitar la proliferación.
2. Añadir un inhibidor de la proliferación como la actinomicina D que no inhiba la migración ni la invasión.
3. Inmunotinción con un anticuerpo anti-Ki67, un marcador que sólo se encuentra en las células proliferantes, y descartar las células Ki67 positivas de los resultados.
Supervisar el ensayo mediante microscopía de vídeo para conocer el historial de cada célula durante el ensayo. Se trata de un método que consume mucho tiempo y muchos datos, y que requiere equipos caros.

Las células suelen ser visibles con la óptica de campo claro sin tinción, especialmente si se dispone de óptica de contraste de fases. Sin embargo, la tinción facilita la visualización de las células y puede revelar estados fisiológicos que la óptica de campo claro no puede revelar. Los ensayos Oris no imponen restricciones en cuanto a la elección de la tinción y, si lo desea, puede utilizar varias tinciones simultáneamente.
Para cuantificar la migración/invasión mediante el cierre del área, recomendamos una tinción citoplasmática fluorescente como TRITC-phalloidin con el fin de maximizar las señales para su detector.

Para cuantificar la migración/invasión mediante el recuento de células, recomendamos una tinción nuclear como DAPI. Al restringir la tinción a los núcleos se crean objetos más pequeños para la obtención de imágenes que con las tinciones citoplasmáticas, lo que proporciona una mayor separación entre las células individuales y, por tanto, recuentos más precisos.

También puede considerar la posibilidad de preetiquetar las células antes de sembrarlas en los ensayos Oris. Sin embargo, algunas tinciones pueden afectar a la migración y/o la invasión, lo que puede crear artefactos experimentales.