Oris 세포 이동 분석과 스크래치 분석의 비교

세포 이동은 배아 발달, 조직 재생, 상처 치유 등 다양한 생리적 과정에 필수적인 요소입니다. 또한, 세포 이동은 종양 전이와 죽상 동맥 경화증에 관여합니다.. 세포 이동을 연구하는 데 일반적으로 사용되는 한 가지 분석법 시험관 내 스크래치 분석법입니다. 스크래치 분석은 개구부의 가장자리에 있는 세포가 안쪽으로 이동하여 스크래치를 닫기 위해 합류하는 세포 단층에 세포가 없는 틈, 즉 "스크래치"를 생성하여 수행됩니다. 세포 이동은 스크래치 생성 시작 시점과 스크래치가 닫히는 동안 사용자가 정의한 간격으로 캡처한 이미지를 비교하여 평가할 수 있습니다. 스크래치 분석은 수행이 간단하고 비용도 저렴합니다. 그러나 스크래치를 생성하는 방법은 실험실마다 다르며 결과는 매우 다양할 수 있습니다. 또한 스크래치 형성 과정은 다음과 같은 것으로 나타났습니다. 근본적인 세포 외 기질 손상 (ECM).

Oris 세포 이동 분석(CMA)은 스크래치 분석의 한계를 해결하기 위해 설계되었습니다. Oris CMA(그림 1)는 웰의 중앙 검출 영역에서 세포를 배제하는 실리콘 스토퍼로 채워진 96웰 플레이트를 사용합니다. 세포가 시드되고 부착되도록 허용된 후 실리콘 스토퍼를 제거하면 각 웰의 중앙에 시드되지 않은 영역이 나타나며, 이 영역으로 세포가 이동하도록 허용됩니다. Oris CMA는 균일한 크기의 검출 영역으로 인해 스크래치 분석에 비해 분석 재현성이 뛰어나며 실리콘 스토퍼로 인해 기본 ECM이 손상되지 않습니다. 

이 애플리케이션 노트에서는 세포 이동을 평가할 때 Oris CMA와 스크래치 분석법을 직접 비교합니다. 또한 두 분석 형식 모두에서 ECM 무결성을 평가합니다.

자료 및 방법

Oris CMA와 스크래치 분석의 모든 단계는 같은 날에 동시에 수행되었습니다.

Oris 세포 이동 분석: 96웰 Oris TC 플레이트의 각 웰을 9µg/mL 콜라겐 I(Trevigen)로 코팅하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다.^oC/5%CO₂. 배양 후 웰을 헹구고 Oris 세포 시딩 스토퍼를 제거한 후 스토퍼를 삽입했습니다. MDA-MB-231 인간 유방 상피 세포(25,000세포/100µL)를 Oris 분석 플레이트의 모든 테스트 웰에 시딩했습니다. 합류 단층이 형성되면 세포를 24시간 동안 혈청에 굶기고 마개를 제거한 후 배지를 혈청 함유 배지로 교체했습니다. 세포가 없는 검출 영역의 사전 이동 영역을 문서화하기 위해 스토퍼 제거 직후에 CCD 카메라가 부착된 Zeiss Axiovert 현미경을 사용하여 위상 이미지를 캡처했습니다. 그런 다음 Oris 분석 플레이트를 37°C에 놓았습니다.^oC/5% CO₂ 를 사용하여 세포 이동을 허용합니다. 

스크래치 분석:  Costar® 6웰 플레이트의 각 웰을 9µg/mL 콜라겐 I(트레비젠)로 코팅하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다.^oC/5% CO₂. 배양 후 웰을 헹구고 MDA-MB-231 세포(500,000세포/2mL)를 Costar® 플레이트의 각 웰에 시드했습니다. 합류 단층이 형성되면 세포를 24시간 동안 혈청에 굶긴 다음 1000µL 피펫 팁을 사용하여 세포 단층을 긁어내고 혈청 함유 배지를 각 웰에 추가했습니다. 샤피 마커를 사용하여 각 웰의 스크래치 근처에 기준점을 만들고 각 스크래치의 위상 이미지를 캡처하여 무세포 검출 영역의 이동 전 영역을 문서화했습니다. Oris 분석 플레이트와 병행하여 스크래치 분석 플레이트를 37°C에 배치했습니다.^oC/5% CO₂ 를 사용하여 세포 이동을 허용합니다. 

24시간 후, Oris 분석 플레이트와 스크래치 분석 플레이트의 테스트 웰을 0.25% 글루타르알데히드로 고정했습니다. 이동 시점을 문서화하기 위해 두 분석 모두에서 위상 이미지를 캡처했습니다. 기준점을 사용하여 이동 전 이미지에서 스크래치의 동일한 영역을 이미지화했습니다. 두 분석 형식 모두에서 세포 이동은 다음을 사용하여 이동 전 및 해당 이동 시점의 검출 영역 면적을 측정하여 평가했습니다. ImageJ v1.42l 분석 소프트웨어. 세포 이동은 다음 공식을 사용하여 계산된 폐쇄 비율로 표시됩니다:

((마이그레이션 전)_지역 - (마이그레이션)_지역 ) x 100 / (마이그레이션 전)_지역  

ECM 무결성 분석: 각 분석에서 ECM의 무결성을 테스트하기 위해 100µg/mL의 콜라겐 타입 I - FITC 접합체(시그마-알드리치)를 Oris 분석 플레이트(마개가 없는 경우)와 Costar® 플레이트의 웰에 코팅하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양했습니다.^oC/5% CO₂. 배양 후, Oris 분석 플레이트에 스토퍼를 삽입하고 두 분석 플레이트의 웰에 멸균 PBS를 추가했습니다. 삽입 후 1시간, 24시간, 48시간이 지나면 스토퍼를 제거하고 Zeiss Axiovert 도립형 현미경을 사용하여 형광 이미지를 캡처했습니다. 앞서 언급한 각 시점에 Costar® 플레이트에 스크래치를 내고 Oris 분석 플레이트에 사용된 것과 동일한 설정을 사용하여 이미지를 캡처했습니다. 

결과

콜라겐 I 코팅 표면에서 MDA-MB-231 세포 이동을 두 가지 이동 분석법(Oris CMA 및 스크래치 분석법)을 사용하여 비교했습니다. 각 분석법의 성능을 비교하기 위해 서로 다른 날에 4개의 개별 실험을 동시에 수행했습니다. 각각의 독립적인 실험에서 Oris CMA를 사용하여 달성한 평균 면적 폐쇄(그림 2A 및 B)는 87%-89% 범위였으며 분산 계수는 3.7-6.5%였습니다(그림 2E). 반대로 스크래치 분석(그림 2C 및 D)을 사용하여 얻은 평균 면적 폐쇄 범위는 69%-77%였으며 분산 계수는 11.3-25.6%였습니다(그림 2E). 이러한 결과는 스크래치 분석법을 사용하여 얻은 결과에 비해 Oris CMA가 실험 간에 더 일관된 결과를 도출하고 재현성이 높다는 것을 보여줍니다. 

그림 2E에 표시된 바와 같이, 스크래치 분석에서 세포 이동은 Oris 분석에서 관찰된 것보다 일관되게 적었습니다. 스크래치 분석에서 세포 이동량이 감소한 이유 중 하나는 스크래치 형성 과정에서 ECM이 손상되었기 때문일 수 있습니다. Kam 등(2008)은 스크래치가 형성되는 동안 ECM이 손상될 수 있음을 입증했습니다. 이 연구에서 이것이 사실인지 평가하기 위해 스토퍼 제거 및 스크래치 형성 후 콜라겐 코팅의 무결성을 평가했습니다. 이미지 필드 전체에 걸쳐 균일한 형광이 나타나는 것으로 볼 때, Oris 세포 시딩 스토퍼는 콜라겐 코팅에 부정적인 영향을 미치지 않았습니다(그림 3A). 반대로 FITC 표지 콜라겐 I로 코팅된 분석 플레이트를 사용한 경우, 스크래치 형성 과정에서 콜라겐 코팅이 손상되었으며, 이는 발표된 연구 결과와 일치합니다(그림 3B). 이러한 결과는 기본 콜라겐 코팅의 손상이 스크래치 분석에서 관찰된 세포 이동 감소에 기여할 수 있음을 시사합니다.  

결론

이 애플리케이션 노트는 일반적으로 사용되는 스크래치 분석과 Oris 세포 이동 분석의 성능을 비교합니다. 이 연구 결과에 따르면 Oris CMA는 스크래치 분석에 비해 재현성이 뛰어나고 실험 간에 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 또한 스크래치 분석의 기계적 스크래치 형성과는 달리 Oris CMA에서 실리콘 스토퍼를 사용해도 기본 ECM이 손상되지 않습니다. 이러한 결과를 종합해 볼 때, ECM의 재현성 및 무결성과 관련하여 스크래치 분석에 비해 Oris CMA가 갖는 이점을 알 수 있습니다.

자세히 알아보기 Oris 세포 이동 분석.