So führen Sie einen Zellmigrationstest durch

Die Zellmigration ist ein grundlegender Prozess bei einer Vielzahl von biologischen Phänomenen. Dazu gehören die Embryonalentwicklung, die Geweberegeneration, Immunreaktionen und die Krebsmetastasierung. Das Verständnis der Mechanismen der Zellmigration ist von entscheidender Bedeutung, um therapeutische Strategien für die Wundheilung, Immuntherapien und die Krebsbehandlung voranzutreiben. Zellmigrationsassays können bei der Untersuchung des Migrationsverhaltens von Zellen unter verschiedenen Bedingungen helfen. 

Dieser Blogbeitrag befasst sich mit der Methodik der Durchführung eines Zellmigrationstests. Er konzentriert sich auf den Scratch-Assay, eine der gängigsten und einfachsten Methoden zur Bewertung der Zellmigration in vitro.

Verständnis der Zellmigration

Wenn wir verstehen, wie Zellwanderungen funktionieren, können wir mehr über ihre spezifischen Signale und die Polarität ihrer Signalmoleküle erfahren. Auf diese Weise können wir Hypothesen darüber aufstellen, wohin sie sich bewegen könnten. Falsche Signale können zu Problemen führen, unter anderem zur Ausbreitung von Krebszellen. 

Die Art und Weise, wie sich eine Zelle bewegt, kann durch verschiedene Kräfte erfolgen. Einige einfache Zellen verwenden Flimmerhärchen oder Geißeln. Kompliziertere Zellen können sich jedoch durch eine Veränderung der Zellform aufgrund ihres Zytoskeletts und ihrer fokalen Adhäsionen oder durch Veränderungen an Zellverbindungen bewegen. 

Zellmigrationstests werden verwendet, um die Zellmigration zu verstehen. Dazu können Zellkulturmedien verwendet werden, um eine Untersuchung durchzuführen und das Zellwachstum zu fördern. 3D-Umgebungen und Mikroskope können auch verwendet werden, um mehr über die Zellmotilität zu erfahren, einschließlich der Vorderkante der Zelle und ihrer Aktinfilamente, die die Zelle vorwärts bewegen. 

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Amöboide Migration

Eine weitere Form der Zellmotilität, die Sie verstehen müssen, ist die amöboide Migration. Anstatt sich durch einen Klebstoff zu bewegen, bewegt sich ihre Plasmamembran in Richtung der Rückseite der Zelle. Die Kraft der Plasmamembran kann ihr helfen, sich durch die sie umgebende Flüssigkeit zu bewegen. 

Diese Art der Migration ist vor allem bei Immunzellen zu beobachten. Wenn eine Gewebeschädigung auftritt, müssen diese Zellen schnell zu ihrer Quelle geleitet werden. Leider nutzt auch die Metastasierung von Krebszellen diese Art der Bewegung. 

Materialien und Methoden für den Zellmigrationsassay

Erforderliche Materialien

• Zellkultur: Eine Zelllinie von Interesse, die für In-vitro-Migrationsstudien gut charakterisiert ist.
• Kulturmedium: Geeignet für die jeweilige Zelllinie, ergänzt mit den erforderlichen Wachstumsfaktoren, Antibiotika und Serum, je nach Bedarf.
• 6-Well- oder 12-Well-Zellkulturplatten.
• Sterile Pipettenspitzen oder Ritzwerkzeuge: Zum Erzeugen eines gleichmäßigen Kratzers.
• Umgekehrtes Mikroskop: Ausgestattet mit einer Kamera zur Aufnahme von Bildern.
• Software zur Bildanalyse: Zur quantitativen Messung der Zellmigration.

Verfahren

1. Zellaussaat: Beginnen Sie mit der Aussaat der Zellen in eine 6-Well- oder 12-Well-Platte und stellen Sie sicher, dass sie eine Monolage bilden. Die Zelldichte sollte so optimiert werden, dass die Konfluenz innerhalb von 24-48 Stunden erreicht wird. Dies ist entscheidend für die Schaffung eines einheitlichen Kratzers.
2. Festlegung einer Basislinie: Sobald die Zellen eine Konfluenz von 100% erreicht haben, waschen Sie die Zellschicht vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um alle Trümmer und nicht haftenden Zellen zu entfernen. Dieser Schritt ist entscheidend, um klare und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
3. Den Scratch erstellen: Verwenden Sie eine sterile Pipettenspitze oder ein spezielles Ritzwerkzeug, um einen geraden Kratzer in die Monoschicht zu machen. Wenden Sie gleichmäßigen Druck und Geschwindigkeit an, um sicherzustellen, dass die Kratzbreite in den verschiedenen Vertiefungen gleichmäßig ist.
4. Waschen und Behandlung Anwendung: Waschen Sie die Vertiefungen nach dem Kratzen vorsichtig mit PBS, um abgelöste Zellen zu entfernen. Dies verringert die durch schwimmende Zellen verursachte Variabilität. Nach dem Waschen frisches Kulturmedium mit oder ohne Prüfsubstanzen zugeben, um deren Wirkung auf die Zellmigration zu untersuchen.
5. Bildgebung: Machen Sie unmittelbar nach dem Anbringen des Kratzers (Zeitpunkt 0) mit einem inversen Mikroskop Fotos des Kratzers. Achten Sie darauf, dass die Bilder an standardisierten Stellen entlang des Kratzers aufgenommen werden, um einen genauen Vergleich im Zeitverlauf zu ermöglichen.
6. Inkubation und Überwachung: Inkubieren Sie die Zellen unter Standardbedingungen (37°C, 5% CO2). Überwachen Sie den Verschluss des Kratzers, indem Sie zu bestimmten Zeitpunkten Bilder aufnehmen, z. B. 0, 6, 12, 24 und 48 Stunden nach dem Kratzer. Die Zeitpunkte können je nach Zelltyp und Versuchsaufbau variieren.
7. Bildanalyse: Analysieren Sie die Bilder mit einer Bildanalysesoftware. Messen Sie die Fläche des Kratzers zu jedem Zeitpunkt. Dann können Sie den Prozentsatz der Schließung im Verhältnis zur anfänglichen Kratzerfläche berechnen. Dies quantifiziert die Zellmigrationsrate.

Erfahren Sie mehr: Alternativen zu Scratch Assays

Interpretation der Ergebnisse

Die Geschwindigkeit, mit der sich der Kratzer schließt, spiegelt die Migrationsfähigkeit der Zellen wider. Eine verstärkte Migration führt zu einer schnelleren Schließung des Kratzers. Eine gehemmte Migration hingegen führt zu einer langsameren Schließungsrate. Durch die Durchführung mehrerer unabhängiger Experimente können Sie die statistische Relevanz und geeignete Kontrollen sicherstellen, insbesondere wenn Sie die Auswirkungen bestimmter Substanzen auf die Zellmigration testen.

Beschränkungen und Überlegungen

Der Scratch-Assay wird zwar wegen seiner Einfachheit und geringen Kosten häufig verwendet, hat aber auch seine Grenzen. Die physische Unterbrechung der Monolage kann Signalwege aktivieren, die nicht die physiologische Zellmigration widerspiegeln. Darüber hinaus unterscheidet dieser Test nicht zwischen Zellmigration und Zellproliferation, die beide zum Kratzverschluss beitragen können. Für detailliertere Studien können fortgeschrittene Assays, wie Transwell-Migrationsassays oder dreidimensionale Migrationsassays, eingesetzt werden.

Erfahren Sie mehr: Vergleich des Oris-Zellwanderungstests mit dem Scratch-Assay

Sind Sie bereit, einen Zellmigrationsassay durchzuführen?

Der Scratch-Assay ist ein wertvolles Instrument für die Untersuchung der Zellmigration. Er bietet Einblicke in die grundlegenden Mechanismen der Zellbewegung und die Auswirkungen verschiedener Substanzen auf das Migrationsverhalten. Mit diesem Wissen können wir weitere Schritte unternehmen, um die Zellmigration zu kontrollieren und die Anzeichen und Ergebnisse spezifischer Signale zu lernen. 

Unabhängig davon, ob es sich um dendritische Zellen oder Zellen der Neuralleiste handelt, können Forscher zuverlässige Daten erhalten, wenn sie standardisierte Verfahren anwenden und die Grenzen des Assays berücksichtigen. Diese Informationen können zu unserem Verständnis der Zellmigration bei Gesundheit und Krankheit beitragen.

Die Beherrschung der Feinheiten von Zellmigrationstests ist für Forscher und Fachleute, die an der Spitze wissenschaftlicher Entdeckungen in Bereichen wie Onkologie, Immunologie und Tissue Engineering stehen, von größter Bedeutung.

Platypus Technologies hat es sich zur Aufgabe gemacht, Ihre Forschungsbemühungen mit modernsten Werkzeugen und innovativen Zellkulturlösungen zu unterstützen. Diese sind darauf ausgelegt, die Genauigkeit und Effizienz von Zellmigrationsstudien zu verbessern. 

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Referenzen

1. Guan JL, Liang CC, Park AY. In vitro Scratch-Assay: eine praktische und kostengünstige Methode zur Analyse der Zellmigration in vitro. Natur-Protokolle. 2007;2: 329-333. doi: 10.1038/nprot.2007.30. 
2. Amon J, Bartolini M, Cathcart J, Colarusso P, Jonkman J, Stevens K, Xu F. Eine Einführung in den Wundheilungstest mit Hilfe der Mikroskopie lebender Zellen. Zelladhäsion und Migration. 2014;8(5): 440-451. doi: 10.4161/cam.36224. 
3. Justus C, Leffler N, Ruiz-Echevarria M, Yang L. In vitro Zellwanderungs- und Invasionstests. Zeitschrift für visualisierte Experimente. 2014;(88): 51046. doi: 10.3791/51046.