FAQs - Test de migration cellulaire Oris

Les essais Oris offrent un environnement physiologiquement plus pertinent que les essais Boyden / transwell, car il n'y a pas de membrane artificielle à travers laquelle les cellules doivent passer. De plus, les mouvements cellulaires peuvent être suivis en temps réel dans les essais Oris, car il n'y a pas de membrane pour interférer avec l'observation microscopique. Cela permet non seulement d'obtenir plus d'informations, mais aussi d'accélérer le développement de méthodes, car le point final est évident à partir de la simple observation de l'essai.

L'essai Oris 3D Embedded Invasion Assay est également supérieur aux essais Boyden / transwell pour l'invasion cellulaire car les cellules sont intégrées en 3D tout au long de l'essai, alors que les cellules sont ensemencées sur une surface en 2D dans les essais Boyden / transwells, ce qui modifie considérablement la physiologie des cellules (par exemple, références 1,2,3,4,5,6,7,8).

Les tests de migration cellulaire d'Oris n'endommagent pas les cellules, contrairement aux tests de grattage. Plus important encore, la zone de détection uniforme exempte de cellules permet d'obtenir des statistiques beaucoup plus robustes que celles des tests par grattage, comme le montre le tableau ci-dessous. cette publication et la présente note d'application illustrent.

Non. Nous recommandons les kits d'assemblage Oris Universal Cell Migration Assembly si vous souhaitez recouvrir les plaques vous-même. Ces kits sont fournis avec les plaques et les bouchons emballés séparément. Enduisez les plaques comme vous le souhaitez, puis insérez les bouchons juste avant de commencer votre expérience.

Les tests Oris Migration, Oris Invasion, Oris Pro Migration et Oris 3D Embedded Invasion sont conçus pour fonctionner avec la plupart des lignées cellulaires adhérentes. Les cellules non adhérentes peuvent également être utilisées dans le test Oris 3D Embedded Invasion. Platypus a réalisé avec succès de nombreux tests sur les produits Oris avec les cellules HT-1080, MDA-MB-231, PC3 et HUVEC. De nombreuses autres lignées cellulaires ont été utilisées par des clients comme vous avec Oris, en tant qu'essai d'invasion 3D. Google Scholar ("Oris" ET "migration cellulaire").

Viser des monocouches confluentes 95-100% autour de la zone d'exclusion cellulaire au début de l'expérience. L'ensemencement à une densité plus élevée peut entraîner la présence de cellules dans la zone de détection au début de l'essai, tandis que l'ensemencement à une densité plus faible produira moins de cellules migrant dans la zone de détection après la migration. En général, 20 000 à 75 000 cellules sont ensemencées par puits dans les plaques Oris et Oris Pro à 96 puits, et 2 500 à 10 000 par puits dans les plaques Oris Pro à 384 puits. Pour votre première expérience, nous vous recommandons de tester plusieurs densités d'ensemencement de cellules différentes, comme décrit dans l'annexe 1 du manuel de l'utilisateur. protocole d'essai.

Pour les essais d'invasion Oris 3D Embedded, nous recommandons d'ensemencer entre 30 000 et 50 000 cellules par puits. Il est possible d'ensemencer jusqu'à 75 000 cellules par puits pour certaines lignées cellulaires, mais de nombreuses lignées de cellules invasives expriment des niveaux élevés de métalloprotéinases matricielles qui peuvent dégrader le collagène au point qu'il s'effondre ou même se liquéfie à des densités cellulaires élevées. L'ajout d'un nombre réduit de cellules améliore ce problème.

Pour obtenir les meilleures statistiques, choisir une durée d'essai permettant aux cellules non traitées de fermer au moins 2/3 de la surface ouverte initiale de la zone de détection, mais moins de 100%. L'un des avantages des tests de migration et d'invasion cellulaire Oris est qu'il est possible d'inspecter l'expérience à tout moment pendant la période d'incubation pour vérifier la distance parcourue par les cellules. La première fois que vous effectuez un test Oris, il suffit d'observer périodiquement les cellules au microscope pour évaluer l'étendue de la migration/invasion et d'arrêter l'expérience lorsque le degré de mouvement approprié est observé.

Étant donné que les vitesses de déplacement des cellules varient considérablement d'un type de cellule à l'autre, les durées d'incubation optimales varient en fonction du type de cellule. Les temps de migration peuvent varier de 16 à 72 heures, tandis que les temps d'invasion peuvent varier de 1 à 6 jours. Pour des expériences prolongées, nous recommandons de changer le milieu de culture ci-dessus avec de nouveaux inhibiteurs toutes les 48-72 heures.

Les kits Oris sont configurés pour être utilisés lors d'une seule expérience. Pour Oris, les bouchons doivent être conservés au réfrigérateur jusqu'à leur utilisation afin de préserver l'ajustement structurel parfait qui génère une zone d'exclusion reproductible et étroitement délimitée. Pour OrisPro, l'humidité de l'incubateur hydrate le gel dans les puits non utilisés, ce qui créera une variabilité dans la taille de la zone d'exclusion et le temps de dissolution du gel dans les expériences suivantes.

Si vous avez besoin de moins de 96 puits par expérience, envisagez le kit d'assemblage de migration cellulaire Oris - FLEX, qui comprend quatre plaques de 96 puits et quatre paquets de 24 bouchons. Chaque plaque ne doit être utilisée qu'une seule fois, avec n'importe quel nombre de bouchons multiple de quatre.

Non. Les bouchons doivent être conservés au réfrigérateur jusqu'à leur utilisation afin de préserver l'ajustement structurel parfait qui génère une zone d'exclusion reproductible et étroitement délimitée. Les bouchons qui ont été conservés à 37°C pendant un certain temps ne s'adapteront pas correctement, ce qui entraînera des zones d'exclusion irrégulières et variables.

La pointe d'un bouchon correctement inséré créera un œil de bœuf au fond du puits. Pour visualiser ce motif, retournez la plaque après avoir inséré les bouchons et inclinez la plaque. Vous pourrez voir cet œil-de-bœuf au centre de chaque puits à travers la surface transparente du fond. Les bouchons qui n'ont pas été bien scellés peuvent être réinsérés jusqu'à ce que la pointe soit correctement placée.

Non. Bien que les plaques à 96 puits soient la "norme industrielle", les dimensions des puits varient d'un fournisseur à l'autre. Étant donné que le bouchon doit être parfaitement ajusté pour générer une zone d'exclusion reproductible et étroitement délimitée, seules les plaques Oris fonctionneront correctement.

Fixez d'abord la plaque en la tenant fermement contre votre surface de travail. Ensuite, faites glisser les dents de l'outil d'obturation entre le haut de l'épine dorsale de la bande d'obturation, en maintenant le dessous de l'outil d'obturation parallèle à la surface supérieure de la plaque. Enfin, soulever verticalement l'outil pour retirer délicatement le bouchon. N'utilisez pas l'outil d'obturation comme un levier pour retirer les obturateurs du puits, car vous risqueriez de déplacer les cellules. Cette réponse vous a-t-elle été utile ? Oui / Non

Les puits de référence pré-migration/invasion sont utilisés pour établir la taille et la position de la zone de détection afin de quantifier l'étendue du mouvement dans les puits expérimentaux.

Pour les tests Oris, vous pouvez laisser quelques bouchons en place jusqu'à ce que vous lisiez les résultats. Les tests Oris Pro n'ayant pas de bouchons, cette méthode n'est pas applicable.

Pour les tests Oris Pro et Oris, il existe d'autres méthodes pour établir les puits de référence :
Il suffit de collecter des images à l'instant zéro, lorsque la migration est sur le point de commencer.
Ajouter le fixateur aux puits répliqués ou à une plaque répliquée au début de l'essai. Cependant, lors de la fixation de cellules dans un sous-ensemble de puits de la plaque, cette méthode risque d'avoir un impact sur les cellules adjacentes aux puits fixés, car elles peuvent être exposées aux vapeurs du fixateur.
Ajouter un inhibiteur de migration ou d'invasion, tel que la cytochalasine D, aux puits de référence au début de l'essai. Veiller à ajouter suffisamment d'inhibiteur pour bloquer complètement le mouvement des cellules.

Vous pouvez également consulter la note d'application correspondante ici.

La plaque d'essai peut avoir été secouée après le retrait des bouchons Oris ou la dissolution du gel Oris Pro. Faire attention lors du transfert des plaques du plan de travail à l'incubateur.

La lignée cellulaire peut être mal collée à la surface de la plaque. Les solutions possibles sont les suivantes :
Si vous avez utilisé une plaque traitée au TC, essayez une plaque recouverte de collagène I ou de fibronectine pour une meilleure adhérence.
En cas d'utilisation de tests Oris, laisser les cellules adhérer plus longtemps avant d'ajouter le milieu de culture.
Si vous utilisez des tests Oris Pro, essayez de réduire le volume dans lequel les cellules sont ensemencées afin qu'elles atteignent plus rapidement la surface de la plaque.

Si la densité cellulaire est élevée, essayez d'ensemencer moins de cellules afin que toutes les cellules aient la possibilité d'adhérer.

Pour les essais basés sur les bouchons Oris, tapoter légèrement la plaque sur votre surface de travail pour répartir les cellules uniformément après l'ensemencement des cellules mais avant de retirer les bouchons.

Pour les essais Oris, ajouter les composés à tester au milieu de culture une fois que les cellules se sont fixées et que les bouchons ont été retirés, mais avant que la migration ne commence.

Pour les tests Oris Pro, ajouter les composés à tester une fois que le BCG s'est dissous et que les cellules se sont fixées, mais avant le début de la migration.
Pour les tests Oris et Oris Pro, le temps d'adhésion dépend de la lignée cellulaire et du revêtement de la plaque, avec des temps d'attachement. Il est possible de retirer et de remplacer le milieu avant d'ajouter les composés à tester afin d'éliminer les cellules non adhérentes. Dans les essais d'invasion, les composés peuvent être incorporés dans les solutions de collagène I et/ou ajoutés au milieu de culture au-dessus du collagène.

Il existe plusieurs options, la plus simple étant la première :
Effectuer l'essai pendant une durée inférieure au temps de doublement des cellules afin de limiter la prolifération.
2. Ajouter un inhibiteur de prolifération tel que l'actinomycine D qui n'inhibe pas la migration ou l'invasion.
Réaliser une immunocoloration avec un anticorps anti-Ki67, un marqueur présent uniquement sur les cellules en prolifération, et éliminer les cellules Ki67-positives des résultats.
Contrôler l'essai par microscopie vidéo afin de suivre l'évolution de chaque cellule au cours de l'essai. Il s'agit d'une approche qui prend beaucoup de temps et de données et qui nécessite un équipement coûteux.

Les cellules sont généralement visibles en champ clair sans coloration, surtout si l'on dispose d'une optique à contraste de phase. Cependant, la coloration rend les cellules plus faciles à voir et peut révéler des états physiologiques que l'optique en champ clair ne peut pas révéler. Les tests Oris n'imposent aucune restriction quant au choix de la coloration, et vous pouvez utiliser plusieurs colorations simultanément si vous le souhaitez.
Pour quantifier la migration/invasion par fermeture de zone, nous recommandons une coloration cytoplasmique fluorescente telle que la TRITC-phalloïdine afin de maximiser les signaux pour votre détecteur.

Pour quantifier la migration/invasion en comptant les cellules, nous recommandons une coloration nucléaire telle que le DAPI. Le fait de limiter la coloration aux noyaux crée des objets plus petits pour l'imagerie que les colorations cytoplasmiques, ce qui permet de mieux séparer les cellules individuelles et donc de les compter plus précisément.

Vous pouvez également envisager de pré-marquer les cellules avant de les ensemencer dans les essais Oris. Cependant, certaines colorations peuvent avoir un impact sur la migration et/ou l'invasion, créant potentiellement des artefacts expérimentaux.