細胞遊走アッセイの実施方法

細胞移動は、様々な生物学的現象における基本的なプロセスである。これには胚発生、組織再生、免疫応答、癌転移などが含まれる。細胞移動のメカニズムを理解することは、創傷治癒、免疫療法、がん治療における治療戦略を進歩させる上で極めて重要である。細胞遊走アッセイは、様々な条件下での細胞の遊走反応を調べるのに役立つ。 

このブログ記事では、細胞遊走アッセイを実施する方法論について掘り下げる。in vitroでの細胞遊走を評価する最も一般的で簡単な方法の一つであるスクラッチアッセイに焦点を当てている。

細胞移動の理解

細胞の移動がどのように行われるかを理解することで、細胞固有のシグナルやシグナル分子の極性をより詳しく知ることができる。そうすることで、細胞がどこに移動できるかを推測することができる。間違ったシグナルは、がん細胞の拡散を含む潜在的な問題を引き起こす。 

細胞が動く方法には、様々な力がある。単純な細胞は繊毛や鞭毛を使う。しかし、より複雑な細胞では、細胞骨格やその焦点接着、あるいは細胞接合部の変化により、細胞の形が変わることで動くことができる。 

細胞遊走アッセイは、細胞遊走を理解するために用いられる。これには細胞培養培地を用いて検査を行い、細胞の成長を促すことができる。3D環境と顕微鏡もまた、細胞を前進させる細胞の最先端とそのアクチンフィラメントを含む細胞運動性についての詳細を知るために使用することができる。 

関連記事 細胞移動のステップとは？

アメーバ状の移動

あなたが理解しなければならない細胞運動のもう一つの形態は、アメーバ状の移動である。接着剤の中を移動するのではなく、細胞膜は細胞の後方へと向かう。細胞膜の力によって、細胞膜を取り囲む液体の中を移動することができる。 

この種の移動は主に免疫細胞で見られる。組織の損傷が起こると、これらの細胞は速やかにその発生源に向かう必要がある。残念ながら、がん細胞の転移もこのタイプの移動を利用する。 

細胞移動アッセイの材料と方法

必要な材料

• 細胞培養：in vitro遊走試験用に十分に特性化された目的の細胞株。
• 培養培地：必要な成長因子、抗生物質、血清を必要に応じて添加した、特定の細胞株に適切なもの。
• 6ウェルまたは12ウェル細胞培養プレート。
• 滅菌ピペットチップまたはスクラッチツール：均一なスクラッチ作成用。
• 倒立顕微鏡：撮影用カメラ付き。
• 画像解析ソフト：細胞の移動を定量的に測定する。

手続き

1. 細胞の播種： 細胞が単層を形成するように、6ウェルか12ウェルプレート に細胞を播種することから始める。細胞密度は、24～48時間以内にコン フルエントになるように最適化する。これは、均一なスクラッチを作るために重要である。
2. ベースラインの確立 細胞が100%コンフルエントに達したら、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞層を穏やかに洗浄し、破片や非付着細胞を取り除く。このステップは、明瞭で再現性のある結果を得るために極めて重要である。
3. スクラッチを作る 滅菌済みピペットチップまたは専用のスクラッチツールを用いて、単層に直線状のスクラッチを入れる。スクラッチ幅が異なるウェル間で均一になるよう、一定の圧力と速度で行う。
4. 洗濯とトリートメント： スクラッチ後、ウェルをPBSで静かに洗浄し、剥離した細胞を除去する。こうすることで、浮遊細胞によるばらつきを抑えることができる。洗浄後、試験化合物を添加または無添加の新鮮な培地を加え、細胞遊走に対する影響を評価する。
5. イメージング： スクラッチ作成直後（時間0）、倒立顕微鏡を用いてスクラッチの写真を撮る。経時的な比較を正確に行うため、傷に沿った標準的な位置で撮影する。
6. インキュベーションとモニタリング： 細胞を標準条件下（37℃、5% CO2）で培養する。スクラッチ後0時間、6時間、12時間、24時間、48時間など、所定の時点 で画像を撮影し、スクラッチ閉鎖をモニターする。時点は細胞の種類や実験デザインによって異なる。
7. 画像解析： 画像解析ソフトウェアを用いて画像を解析する。各時点でのキズの面積を測定する。そして最初のスクラッチ面積に対する閉鎖のパーセンテージを計算する。これにより細胞遊走率が定量化される。

もっと詳しく スクラッチ・アッセイの代替法

結果の解釈

傷の閉鎖速度は細胞の遊走能力を反映する。遊走が亢進すれば、スクラッチの閉鎖は速くなる。しかし遊走が阻害されると、閉鎖速度は遅くなる。複数の独立した実験を行うことで、特に細胞遊走に対す る特定の化合物の効果を調べる場合に、統計的な妥当 性と適切なコントロールを確実にすることができる。

制限と考慮事項

スクラッチアッセイは、その簡便さとコストの低さから広く用いら れているが、限界もある。単層が物理的に破壊されることで、生理的な細胞遊走を 反映しないシグナル伝達経路が活性化される可能性がある。加えて、このアッセイ法では、スクラッチ閉鎖の一因となりうる細胞遊走と細胞増殖を区別することができない。より詳細な研究には、トランスウェル遊走アッセイや三次元遊走アッセイなどの高度なアッセイが採用されるかもしれない。

もっと詳しく オリス細胞移動アッセイとスクラッチアッセイの比較

細胞移動アッセイを実施する準備はできていますか？

スクラッチアッセイは、細胞遊走の研究において貴重なツールとなる。細胞の移動の基本的なメカニズムや、移動行動に対する様々な物質の影響についての洞察を与えてくれる。この知識があれば、細胞遊走を制御するためのさらなるステップを踏み、特定のシグナルの兆候と結果を知ることができる。 

樹状細胞であれ神経堤細胞であれ、標準化された手順に従い、アッセイの限界を考慮することで、研究者は信頼できるデータを得ることができる。この情報は、健康と病気における細胞移動の理解に貢献することができる。

腫瘍学、免疫学、組織工学などの分野で科学的発見の最前線に立つ研究者や専門家にとって、細胞遊走アッセイの複雑さをマスターすることは最も重要である。

プラティパス・テクノロジーズ社は、最先端のツールと革新的な細胞培養ソリューションにより、お客様の研究努力を支援することに専念しています。これらは細胞遊走研究の精度と効率を高めるように設計されています。 

細胞遊走アッセイの世界をより深く知り、当社の先進技術がお客様の研究プロセスをいかに効率化できるかをご覧ください。訪問 カモノハシテックの細胞移動アッセイガイド 可能性を追求し、あなたの研究を新たな高みへと引き上げるために。

関連記事 オリス セルマイグレーションによる比類なき精度

参考文献

1. Guan JL, Liang CC, Park AY. インビトロ スクラッチアッセイ：細胞遊走の簡便で安価な分析法 試験管内で ネイチャー・プロトコル 2007;2: 329-333. 
2. エイモンJ、バルトリーニM、キャスカートJ、コラルッソP、ジョンクマンJ、スティーブンスK、シューF. ライブセル顕微鏡を用いた創傷治癒アッセイの紹介。細胞接着と移動。 2014;8(5):440-451. doi: 10.4161/cam.36224. 
3. Justus C, Leffler N, Ruiz-Echevarria M, Yang L. インビトロ 細胞遊走および浸潤アッセイ。 可視化実験ジャーナル。 2014;(88):51046. doi: 10.3791/51046.